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MicroRNA—146a调控肺泡巨噬细胞炎症反应方法分析

2015-06-05 10:33:48  字体:   打印 收藏 

摘 要:microRNA是一类大小约22个核苷酸长度的内源性非编码小分子RNA[1],主要通过识别并结合靶基因 mRNA 的3端非编码区,在转录后水平抑制蛋白的翻译或促进靶基因的降解[2-3]。有研究发现微小RNA参与肺内炎症反应的调控[4],miR-146a是其中较有代表性的一个。本课

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  microRNA是一类大小约22个核苷酸长度的内源性非编码小分子RNA[1],主要通过识别并结合靶基因 mRNA 的3’端非编码区,在转录后水平抑制蛋白的翻译或促进靶基因的降解[2-3]。有研究发现微小RNA参与肺内炎症反应的调控[4],miR-146a是其中较有代表性的一个。本课题组前期研究发现,用LPS刺激肺泡巨噬细胞,miR-146a的表达水平升高,并且升高程度与TNF-α mRNA呈负相关[5];转染miR-146a能下调LPS诱导肺泡巨噬细胞TNF-α的表达[6],表明miR-146a能抑制LPS诱导肺泡巨噬细胞的炎症反应。本实验拟进一步探讨miR-146a调控肺泡巨噬细胞炎症反应的机制,为体内试验提供理论依据。

  1 材料和方法

  1.1 材料

  大鼠肺泡巨噬细胞NR8383(上海中国科学院细胞库);LPS(E.coli 0111:B4);Pre-miRTM miR-146a前体、CyTM3标记的Pre-miRTM阴性对照(美国ABI公司);大鼠 TNF-α ELISA 检测试剂盒(上海森雄科技实业有限公司) ; PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR荧光染料试剂Ⅱ(SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ)PCR 检测试剂盒(大连宝生物工程有限公司);抗IRAK-1 抗体,抗TRAF-6 抗体、抗NF-κB p65抗体(美国abcam公司)。

  1.2实验分组及处理

  将体外培养的 NR8383 细胞按每孔1.5×106个接种至6孔板,每孔2 mL,每组2个复孔。转染组转染50 nmol/L的Pre-miRTM miR-146a前体,对照组转染50 nmol/L 的 CyTM3 标记的 Pre-miRTM 阴性对照,摇匀后继续培养24 h,随后加入1 μg/mL 终质量浓度的 LPS 处理细胞6 h,离心收集细胞和上清液,-80 ℃保存。

  1.3检测指标及方法

  1.3.1免疫荧光法观察 NF-κB p65 核移位情况将细胞爬片放置于24孔板;甲醇丙酮固定细胞,0.5%TritonX-100 PBS 透化细胞;再放入含10%驴血清的 PBS 中4 ℃封闭;孵育一抗:用0.5%TritonX-100 PBS稀释兔抗 NF-κB p65(1∶50),常温下孵育4 h后漂洗;孵育二抗:用10%驴血清的 PBS 稀释 Alexa Flour 488 驴抗兔绿色荧光标记二抗(1∶200),室温下孵育20 min后漂洗;用 Dapi 染核,滴加防荧光粹灭剂、固定封片,在Olympus IS71倒置荧光显微镜下拍照分析。

  1.3.2ELISA 检测 TNF-α 蛋白含量收集细胞上清液,按照 ELISA 试剂盒操作说明书步骤操作检测 TNF-α 蛋白含量。

  1.3.3RT-qPCR 检测 IRAK-1、TRAF-6 及TNF-α mRNA 表达采用 TRIzol 法提取细胞内总 RNA,通过紫外分光光度计测定总 RNA 浓度,琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 完整性及纯度。按照 PrimeScript逆转录试剂盒说明书操作,所有操作均在冰上完成。10 μL 的逆转录反应体系:PrimeScript 缓冲液 2μL,PrimeScript 逆转录酶复合物 10.5 μL,多聚胸腺嘧啶引物 0.5 μL,随机的6核苷酸引物 0.5 μL,总RNA 500 ng,加无核酶水至总体积10 μL。反应条件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。20 μL 的 PCR反应体系包括:cDNA 2 μL,上游引物 0.8 μL,下游引物 0.8 μL,SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL,无核酶水6 μL。反应条件:95 ℃ 30 min,40个扩增循环(95 ℃ 5 s,57 ℃ 20 s,72 ℃ 27 s)。选取β-actin 作为内参,检测IRAK-1 mRNA、TRAF-6 mRNA及TNF-α mRNA的表达,相对表达量采用2-ΔΔCt计算。引物序列及长度见表1。

  1.3.4IRAK-1、TRAF-6、NF-κB p65 蛋白表达收集细胞,离心,弃上清,提取总蛋白或分别提取胞核蛋白、浆蛋白,用BCA法测定蛋白浓度。完成聚丙烯酰胺凝胶电泳(每孔加样20 μL)、转膜、封闭,孵育一抗,兔抗 IRAK-1(1∶2000)、兔抗 TRAF-6 (1∶1000)、兔抗 NF-κB p65(1∶500)和鼠抗 β-actin(1∶3000)/兔抗 Lamin B1(1∶1000),4 ℃孵育过夜,漂洗3次;孵育二抗,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 、山羊抗鼠 IgG(1∶4000),37 ℃孵育1-2 h,漂洗3次,暗室内曝光、显影并定影,行X胶片扫描,通过 Quantity One 软件进行数据分析,检测 IRAK-1、TRAF-6及胞浆NF-κB p65蛋白以 β-actin 作为内参,细胞核内NF-κB p65蛋白以 Lamin B1作为内参。

  1.4统计学方法

  采用 SPSS 17.0 统计软件分析数据,数据以均数±标准差(x±s)表示,两样本比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

  2结果

  2.1过表达 miR-146a 对 LPS 诱导的 NR8383 细胞 NF-κB p65 核移位的影响

  2.1.1免疫荧光法观察细胞 NF-κB p65 核移位的变化倒置荧光显微镜下观察到NF-κB p65 呈绿色荧光,Dapi 染核后呈蓝色荧光。与对照组比较,观察到转染组 NF-κB p65 胞核中表达减少,胞浆中增多。见图1。

  2.2过表达 miR-146a 对 LPS 刺激的NR8383细胞 TNF-α表达的影响

  与对照组相比较,RT-qPCR 检测NR8383细胞转染miR-146a后TNF-α mRNA表达下调至(0.47±0.06)倍(P<0.05);ELISA 检测TNF-α蛋白表达也明显下降(211.5±30.39)pg/mL vs.(616.6±42.28)pg/mL,P <0.01。见图3。

  2.3过表达 miR-146a 对 LPS刺激的NR8383细胞 IRAK-1和TRAF-6蛋白表达的影响

  与对照组比较,过表达miR-146a后,转染组IRAK-1 mRNA增加为(1.16± 0.1)倍,TRAF-6 mRNA增加为(1.19± 0.16)倍,差异均无统计学意义(P>0.05);转染组IRAK-1 蛋白下降为(0.73±0.05)倍,TRAF-6 蛋白下降为(0.64±0.09)倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

  3讨论

  miR-146a 是第一个被发现能够调节免疫系统的微小RNA,当机体存在有感染、肿瘤时miR-146a 表达上调[7-9],上调人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)的 miR-146a 后将负性调控炎症因子的释放[10]。研究证实在 LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中 miR-146a 表达上调;本研究发现过表达 miR-146a 后,用 L

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